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化學發(fā)光 | IVD行業(yè)技術(shù)擔當（下）

更新時間：2022-04-13 瀏覽次數(shù)：3031

上一期，我們大致介紹了化學發(fā)光免疫分析的原理和優(yōu)缺點，下面我們就來詳細說說三種分類的不同之處。

直接化學發(fā)光免疫分析

直接化學發(fā)光免疫分析（CLIA）是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標記的化學發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物——acridinium ester (A E) , 是有效的發(fā)光標記物。其通過起動發(fā)光試劑（NaOH?、H?O?）作用而發(fā)光，強烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成，為快速的閃爍發(fā)光。

吖啶酯作為標記物用于免疫分析，其化學反應(yīng)簡單、快速、無須催化劑；檢測小分子抗原采用競爭法，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結(jié)合少，本底低；與大分子的結(jié)合不會減小所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度。

CLIA開發(fā)主要包括以下幾個步驟：

磁珠包被抗體

( 以下步驟需依據(jù)項目不同進行工藝優(yōu)化 )

BeaverBeads®Streptavidin鏈酶親和素磁珠

利用鏈酶親和素和生物素的高特異性結(jié)合能力，BeaverBeadsRStreptavidin可與biotin標記的高純度抗體/多肽分子或核酸分子特異性結(jié)合，并具有級聯(lián)放大的作用，是一種通用的具有標記和捕獲性能的固相介質(zhì)原料。

根據(jù)粒徑的不同，產(chǎn)品可用免疫檢測、探針捕獲、細胞分選等領(lǐng)域，尤其適用于化學發(fā)光免疫診斷。相關(guān)海貍產(chǎn)品如下：

BeaverBeads®NHS生物配體快速偶聯(lián)磁珠

表面為NHS基團修飾的磁珠，能夠與帶有伯胺基團的蛋白和其他分子形成穩(wěn)定的肽鍵，用于親和純化或者分析檢測抗體、抗原和其他生物分子。

與傳統(tǒng)的羧基、氨基磁珠相比，無需事先采用EDC/NHS或戊二醛進行活化，只需簡單講含伯氨基的生物配體溶解于偶聯(lián)緩沖液中，室溫下將蛋白溶液與NHS磁珠混合即可將生物配體共價偶聯(lián)到磁珠上，偶聯(lián)效率可達90%以上；偶聯(lián)體系pH為5-9. 相關(guān)海貍產(chǎn)品如下：

BeaverBeads®Polymer聚合物磁珠

具有快速磁響應(yīng)性超順磁性、良好的分散性、粒徑均一、極低的非特異性吸附和豐富的結(jié)合位點等特點。在特定試劑（如EDC/NHS）作用下，將多種生物配體（蛋白、多肽、寡聚核苷酸、藥物分子等）共價偶聯(lián)到磁珠表面。常用于檢測、捕獲等試驗。相關(guān)海貍產(chǎn)品如下：

Beaver Magnetic Seprator stand磁性分離器

為快速分離磁珠的手工操作或高通量的自動化操作而設(shè)計的一系列不同規(guī)格的專用磁性分離工具，適用于抗體純化、免疫沉淀、免疫共沉淀、細胞分選、核酸分離等相關(guān)實驗。相關(guān)海貍產(chǎn)品如下：

吖啶酯標記抗體

①將0.5mg抗體用標記緩沖液（0.1M pH7.4 PB）預處理；

②將0.1mg的吖啶鹽加入到預處理的抗體中，放置于恒溫搖床中避光孵育過夜；

③標記完成后，將結(jié)合物純化，加入BSA等蛋白保護劑，4℃避光保存。

吖啶酯是一類可用作化學發(fā)光標記物的化學物質(zhì)，吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物在有H?O?的稀堿性溶液中即能發(fā)光，不需要催化劑，發(fā)光系統(tǒng)簡單。

同時這類化合物的發(fā)光為閃光型，加入發(fā)光啟動試劑后0.4s左右發(fā)射光強度即達到最大，半衰期為0.9s左右，非常省時。

基于上述特點，為增強吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物的化學發(fā)光強度，有些在發(fā)光啟動試劑中加入triton x-100、tween-20等表面活性劑。相關(guān)產(chǎn)品如下：

上機檢測實驗

①將磁珠包被物和吖啶酯標記物分別稀釋至工作濃度，配成試劑；

②設(shè)置全自動化學發(fā)光儀，裝載試劑，標準品質(zhì)控品樣本分別上機，選擇對應(yīng)的項目，直接進行檢測；

③檢測剩余時間及檢測結(jié)果會顯示在屏幕上，可通過“查詢”查看歷史數(shù)據(jù)，點擊“導出”可將數(shù)據(jù)保存為Excel格式文件。

間接化學發(fā)光免疫分析

間接化學發(fā)光免疫分析又稱化學發(fā)光酶免疫分析，以酶標記生物活性物質(zhì)進行免疫反應(yīng)，免疫復合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測試。常用的標記為HRP和AP，它們的底物分別為魯米諾和AMPPD。

具體工藝流程：

包被抗體的磁性微粒

加入樣本、標準品

清洗

加入酶標抗體/生物素化抗體

洗板

加入鏈酶親和素HRP

清洗

加入底物液

測試發(fā)光信號（如是板式發(fā)光可參考Elisa操作方式）

化學發(fā)光 (ECL)底物相關(guān)產(chǎn)品：

電化學發(fā)光免疫分析

電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA）是電化學發(fā)光和免疫測定相結(jié)合的產(chǎn)物，是標記免疫測定技術(shù)之一。

在電極表面有電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應(yīng)，用電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕 [Ru(bpy) 3 ] 2+ 標記 Ab，通過 Ag-Ab 反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的 Ag或 Ab 進行定量 / 定性。

ELIA 具有高度敏感，可達 Pg/ml 或 pmol ；特異性強，可重復性好，CV<5%；測定范圍寬；試劑穩(wěn)定，無毒害，無污染，有效期長。操作簡單，易于自動化。

三聯(lián)吡啶釕：

三丙胺（TPA）：

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